小候子种麦子200子(一)
小候子种麦子200子(二)
(大标)小麦种植技术---播前准备（作者）佚名 （导语） 又是一年播种之际。在全球粮食预警危机的时刻，我国的小麦播种怎样能更好的抵抗自然条件，以及达到高产，对于国家粮食的储备是极为重要的事情。我们知道小麦播种之前，要认真做好各项准备工作。尤其要注意做好整地保墒、备足底肥、造墒和选种、种子处理等工作。针对各种问题，小编邀请了农业专家来为大家支招。一、建设高产稳产田，满足小麦对土、肥、水的要求（一） 精细整地 对整地提出的质量要求应是：深、细、透、实、平。 深：机耕的应在25～27厘米；畜力犁地耕到18～22厘米。根据各地的大量资料表明：深耕由15～20厘米加深到25～33厘米，一般能使小麦增产15%～25%。一般麦田可三年深耕一次，其余二年进行浅耕，深度16～20厘米即可。 细：小麦幼芽顶土能力较弱，在坷垃底下，会出现芽干现象，易造成缺苗断垄，冬季因麦根透风而遭冻害。所以耕地后必须把土块耙碎、耙细，保证没有明暗坷垃。 透：就是要求耕透、耙透，做到不漏耕、不漏耙。 实：就是表土细碎，下无架空暗垡，达到上虚下实。对过于疏松的麦田，应进行播前镇压或浇塌墒水。 平：就是耕前粗平，耕后复平，做畦后细平，使耕层深浅一致。一般麦田坡降要求不超过0.3%，畦内起伏不超过3厘米。（二）在一年一作的休闲旱麦田上，要大力推广“四早三多”纳保结合的蓄水保墒耕作技术。四早就是：早灭茬，破土保表墒；早深耕，纳雨贮深墒；早细犁，破垡活土匀墒；早带耙，立足秋旱收全墒。三多就是：多浅犁，多细犁，多耙地。具体做法是：小麦随收随灭茬，伏前抢墒深耕，雨后抢墒犁地耙地，伏天多犁多耙，犁后带耙。把深耕提前一个节令，把立秋带耙改为伏里带耙，立秋后多耙少犁，播种前无雨只耙不犁。（三） 施足基肥 小麦施肥实行粗细结合，氮磷配合，采用粗肥、氮肥、磷肥“三肥坐底”的方法，是一项显著的增产措施，也是培育冬前壮苗的有效手段。增施有机肥料，可以培肥地力，改善土壤结构，是建设稳产、高产农田的根本途径之一。因此，要本着“粗肥为主，化肥为辅”的原则，通过各种途径，广辟肥源，为麦田备足底肥。在施肥方法上，基肥要结合深耕整地，均匀撒施翻埋在土里，切忌暴露在地面上，以免肥分损失。施肥量较少，应采取集中施肥法；施肥量较多，以普施为好，然后翻耕。施肥量多时，可以分层施用，以五分之三地粗肥，在耕地前撒施深翻，再用五分之二优质粗肥连同要施地磷肥、氮
肥混后耙地前撒施浅埋入土中。（四） 造好底墒，足墒下种 足墒下种是确保苗全苗壮的重要措施。浇足底墒水，不仅能满足小麦出苗和苗期的生长需要，而且为中、后期生长奠定良好的基础。一般认为小麦种子发芽的临界土壤含水量为15%，沙土地含水量若小于15%～16%；二性土含水量小于17%～18%；粘土地含水量小于20%，都应在浇足底墒水后播种。浇水方法可以采取带茬洇地(即耕前浇水)，有条件的最好在耕地整平后浇塌墒水，一般每亩浇水50～60立方米。在没有浇底墒水的地区，一方面要多保蓄伏雨、秋雨，防旱蓄墒；一方面要快收快耕不晾茬，随耕随耙不晾垡，抢墒播种，尽量适时播种，提高播种质量，确保苗全、齐、匀、壮。二、选用优良品种： 种子是高产、优质、高效的内因。及时更新和更换良种，实行品种合理布局和搭配，搞好区域化种植，良种良法配套都能在生产上起到十分重要的作用。要因地制宜实行品种的合理布局与合理搭配。良种选用还必须根据当地自然条件、栽培条件、产量水平以及耕作种植制度特点进行选择。三、做好种子处理工作 在播前对生产用的种子要进行筛选、晒种和拌种。(一) 精选种子： 选用发芽率高（发芽率在95％以上）、发芽失强、无病害、无杂质地、大而饱满、整齐一致的籽粒做种。(二) 晒种： 播前晒种2～3天，可促进种子后熟，使出苗快而整齐。(三) 种子处理：1、防治病害（1） 变温浸种：先将麦种用冷水预浸4~6小时，捞出用52～55度温水浸1～2分钟，使种子温度达到50度，再捞出放入56度温水中，保持水温55度，浸5分钟取出，用凉水冷却后晾干播种，对预防小麦散黑穗病效果很好，但必须严格控制温度和时间。（2） 恒温浸种：将麦种放入50～55度热水中，立即搅拌，使水温迅速降至45度，在此温度下浸3小时取出，冷却后晾干播种，可以有效地防治小麦散黑穗病、赤毒病、颖枯病等。（3） 石灰水浸种：先用50公斤水溶解0.5公斤优质生石灰，除去渣滓后浸入选好的麦种，使水面高出种子10～15厘米，并保持静置，不能搅动水面；浸泡时间视气温而定：在气温为20度时浸泡3～5天，25度时浸泡2～3天，30度时仅需要1天。浸泡好的麦种不需用清水冲洗，摊开晾干后即可播种，对预防小麦散黑穗病、秆黑粉病、赤霉病、叶枯病等，均有良好的效果。（4） 萎锈灵拌种：用有效成分为75%的萎锈灵可湿性粉剂按种子量0.3%拌种，可以有效地防治小麦散黑穗病，并能兼治小麦种子上或土壤中的小麦腥黑穗病和秆黑粉病。（5） 粉锈宁拌种：粉锈宁是一种新型、高产、内吸性
杀菌剂，对小麦多种病害有特效。据试验，用20%粉锈宁乳油按种子量的0.08～0.1%拌种，可以防治小麦散黑穗病、腥黑穗病和秆黑粉病；按种子量的0.2拌种，可以防治小麦锈病、白粉病和纹枯病；按种子量的0.3%拌种，可以防治小麦全蚀病和根腐病等。2、防治地下害虫（1） 甲基乙硫磷或辛硫磷拌种用40%甲基乙硫磷乳油50毫升或50%辛硫磷乳油100毫升，对水2～3公斤，拌麦种50公斤，拌匀后堆闷2～3小时，对蝼蛄、蛴螬、金针虫等害虫有特效。3、病虫兼治（1） 甲基乙硫磷(或辛硫磷)＋粉锈宁拌种：在地下害虫和小麦全蚀病、根腐病、纹枯病以及黑穗病等混合发生区，可用40%甲基柳磷乳油50毫升(或50%辛硫磷乳油100毫升)，加20%粉锈宁乳油50毫升，对水2～3公斤，拌麦种50公斤，拌匀后堆闷2～3小时播种。（2）“3911”＋粉锈宁拌种：用75%的“3911”乳油150毫升，加20%粉锈宁乳油20毫升，对水2～3公斤，拌麦种50公斤，可兼治小麦白粉病、根腐以及地下害虫、田鼠等。（3）“3911”拌种：在单纯以小麦病毒病(主要有丛矮病和黄矮病等)为主的地方，用75%的“3911”乳油150毫升，对水3公斤，拌麦种50公斤，拌匀后堆闷12小时播种，对防治传毒昆虫灰飞虱和小麦蚜虫，控制病毒病流行有特效，并能兼治田鼠和地下害虫。（4）种衣剂拌种：种衣剂是北京农业大学研究发明的一种专门用于农作物种子包衣的新型药、肥复合制剂。它不同于一般的拌种剂，当被包的种子上时，能迅速固化成膜，随种子播入土壤后遇水吸胀、药、肥缓慢释放，能起到防治多种病虫害和促进幼苗健壮生长的作用。拌种时，每亩用种衣剂原液75～100克，直接倒入经过精选的麦种上搅拌均匀即可。
小候子种麦子200子(三)
小候子种麦子200子(四)
小候子种麦子200子(五)
小候子种麦子200子(六)
小候子种麦子200子(七)
第四章 小麦胚乳特异性启动子克隆及活性研究
引言
小麦 HMW-GS 是一类种子贮藏蛋白，它的表达具有很高的胚乳专一性。因此，克
隆了 HMW-GS 基因的启动子，分析其序列特征，找出其与胚乳特异性有关的元件，为 HMW-GS 的种子特异性表达提供理论依据，也为利用转基因技术改良小麦品质所需的 高效种子特异性启动子奠定基础。本章拟解决以下问题：
扩增并克隆 HMW-GS 启动子。
构建 HMW-GS 启动子与 GUS 基因融合的瞬时表达载体。
利用基因枪技术将其导入小麦叶片及种子中，通过瞬时表达、GUS 染色检测以验证 克隆的启动子具有胚乳特异性。为下一步利用基因工程技术改良小麦品质奠定基础，也 是以小麦种子作为生物反应器生产外源蛋白的前提。
1 材料与方法
植物材料
小麦：Xiaoyan 6
菌株与质粒
受体菌株：JM109（陕西省农业分子生物学重点实验室保存）
克隆载体：pMD18-T（大连宝生物工程有限公司），质粒图谱及多克隆位点见图
2 基因组 DNA 的抽提
以小麦种子（Xiaoyan 6）在室温下暗培养 7 天后的黄化苗为材料进行基因组 DNA
提取。DNA 抽提液为 DNA extraction、Nuclei lysis buffer 和 5% sarkosyl 按 1:1:0.4 比例 混匀，再加入亚硫酸氢钠（3.8 g/L）,65℃预热，即为抽提液。基因组 DNA 抽提步骤及 试剂配制如下：
1． 0.1g 左右的材料液氮磨碎放入 1.5mL 的管子中，加入 700μL 的抽体液（65℃ 预热）混匀，放入 65℃水浴中，裂解 40～60 分钟，期间温和混匀几次。
2． 取出裂解好的 DNA ，加入 700μL 氯仿：异戊醇（24:1），猛烈混匀，离心 （1000 r/min,10 分钟）。
3． 取上清于新管中，（不要混入氯仿），加入 0.8-1 倍预冷异丙醇，缓慢混匀后， 再猛烈混匀，使 DNA 成团，-20℃放半小时以上。
4． 将析出的 DNA 离心，14000 r/min,10 分钟。
5． 去掉上清，将沉淀用 1mL 70% 乙醇清洗一次，离心干燥，溶于 100μL TE 或 水中，用时稀释 10 倍，取 2μL 作 PCR（25μL 体系）。
1. DNA extraction : 500mL
31.885g sorbitol
6.05g tris PH8.2
2. Nuclei lysis buffer: 500mL
100mL 1mol/L Tris PH7.5
100mL 0.25 mol/L EDTA
200mL 5 mol/L NaCl
10g CTAB
100mL ddH20
3. 5% sarkosyl 500mL
25g N-lauroylsarcosine (N-月桂酰肌氨基钠盐)
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3 Genomic PCR
引物P1/P2是根据HMW-GS基因的N-端部分编码区及其上游启动子部分的同源序
列设计的,并在 P2 引物的 5’端引入 BamHⅠ酶切位点。能扩增 HMW-GS 启动子 1kb 左 右的片段，引物由上海博亚合成。
P1：5'> GGAAGCTTAGTGATGGCGTGAG <3'；
P2：5'>TCGGATCCAGCGGCGGTGAGAG<3'
50μL PCR 反应体系中含模板 DNA100ng，P1/P2 10 pmol, TaqDNA 聚合酶 2U（邓
志勇博士惠赠），0.2mmol/L dNTPs, 5μL 的 10×PCR 反应液(500mmol/L KCI,100mmol/L Tris-HCI,PH 8.3 ,15mmol/L MgCI
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)。
PCR 反应采用三段法，反应参数为：95℃预变性 4min，以 95℃变性 45Sec，58 ℃退火 45Sec, 72℃延伸 1min 循环 26 次，最后 72℃延伸 7min。
4.1.5 PCR 产物的克隆与序列测定
PCR 产物在 1％的琼脂糖凝胶中电泳，在紫外灯下切取目的片段，回收后连接到
Takara 公司的克隆载体 pMD18-T Vector 上，转化至感受态宿主菌 JM109 中，在涂有 Amp/X-gal/IPTG 的 LB 平板上进行蓝/白斑筛选，再通过菌落 PCR 和酶切初鉴定后，重 组质粒命名为 pMDH，由大连宝生物工程有限公司进行测序，并对测序结果进行比较分 析。具体操作过程如下：
1. 连接 反应体系采用 10μL (16℃连接过夜)
2×连接 Buffer（含 T4－DNA 连接酶） 5 μL
Vector 1 μL
目的片段 4 μL
2. 转化
[131]
⑴200μL 感受态细胞，冰上解冻后轻轻将细胞均匀悬浮。
⑵加入 10μL 连接液轻轻混匀，冰浴放置 30min。
⑶42 ℃热激 90 秒，冰浴 5min。
⑷加入 800μL LB 培养基，于 37℃180 r/min 震荡培养 1h。
⑸吸取 50μL 细菌培养液涂布在预先涂有 4μL IPTG(100mmol/L)和 40μL X-gal (20mg/mL)的平板上，然后 37 ℃过夜培养。
3. PCR 筛选
用 M13 Forward 和特异引物 P2 对白斑进行菌落 PCR 反应，根据扩增条带的有无 和条带的大小来筛选插入目的片段及其插入方向。
4．质粒 DNA 的提取
提取经扩大培养经 PCR 初步筛选的阳性菌落。
⑴菌液移入 1.5mL 离心管，12 000r/min 离心 30sec，倒去上清液；小麦胚乳特异性启动子的克隆及高分子量谷蛋白 14 亚基基因的原核表达
⑵加入 100μL 预冷的溶液 I [50mmol/L 葡萄糖，10mmol/L EDTA（pH8.0）,25mmol/L Tris-HCl(pH8.0)]，用涡旋震荡器充分悬浮沉淀；
⑶加入 150μL 溶液 II [0.2 mol/L NaOH,1% SDS （现配）]，快速颠倒温和混匀，室 温放置 3min；
⑷加入 150μL 预冷的溶液Ⅲ（3 mol/L K
+
，5 mol/L Ac
-
）温和混匀，冰浴 3min；
⑸12 000r/min 离心 3min，转移 400μL 上清液至另一 1.5mL 离心管中；加入 800μL 无水乙醇（2×上清液体积）到上清液中，混匀，室温放置 3min, 12 000r/min 离心 3min 使质粒 DNA 沉淀；
⑹弃尽上清，用 200μL 的 TE 溶解沉淀，之后加入 200μL 冰预冷的 LiCl 溶液（5 mol/L），冰浴 5min 后 12 000r/min 离心 3min；
⑺转移上清到另一离心管中，加入 0.8 mL 无水乙醇，混匀后室温静置 3 min，
12000 r/min 离心 3min，去掉上清后用 1 mL 70%的乙醇洗涤沉淀，弃尽液体，用含有 RNA 酶的 TE 溶解质粒 DNA 沉淀。
5．酶切鉴定
提取阳性菌落质粒 DNA，分别用 EcoR I 和 PstⅠ进行双酶切。采用 20μL 反应体
系，其中质粒 10μL，限制性内切酶各 0.5μL，另加 RNase（1 mg/mL）0.5μL，混匀， 10 000r/min 离心 20sec，37℃反应 1.5h。鉴定后的重组质粒由大连宝生物工程有限公司 进行测序。
4小麦种子特异性瞬时表达载体构建
第一步：克隆目的片段； BamHI+EcoRI 切 pBI121 双元载体分离
GUS+NOS
第二步：在 HMW-GS 启动子后插入 GUS+NOS
EcoRI
5 启动子活性测定
GUS 基因的瞬时表达
2、转p1Ebxp一uidANoS小麦植株的获得
小麦转化受体材料为Bobwhite(CIMMYT国际玉米和小麦改良中心)，取受粉
后12一15天的小麦幼胚(直径约为1.Olnln)，诱导培养基上25℃暗培养1天，随即转 移至高渗培养基上25oC暗处理4一6小时，将包裹有p1EbxP一uidANoS和pubiBar (p1Ebxp一UidANos:pubiBar(质量比)=1:1)的金粉颗粒或者包裹有puidAN。S
和 pUbiBar(pUidANos:pUbiBar(质量比)=1:一)的金粉颗粒(对照)分别轰击
小麦幼胚，分别继续在高渗培养基上25℃暗培养18一20小时。然后转移至诱导培养 基上恢复培养14天一16天，取生长状态良好的胚性愈伤转移至筛选培养上培养30天 左右(25℃16hr/shr光照/黑暗)，其间更换一次培养基。随后将分化正常的抗
性苗转移至生根培养基上，约两周后将根系发育正常的幼苗转移至温室培养，即得
到转入plEbxP一uidANoS和pubiBar的小麦植株(转plEbxP一uid胡05小麦植株)或转入 pUidANos和pUbiBar的小麦植株(转puidANoS小麦植株，阴性对照)的T。代植株。 各培养基组分如下所述:
诱导培养基:MS基本培养基加2，4一D(Sigma.，美国)2.smg，蔗糖(北京益利
精细化学品有限公司)309/L，琼脂9克/L， pH5.8。
高渗培养基:MS基本培养基，麦芽糖(北京益利精细化学品有限公司)150克/L，
琼脂9克/L， pH5.8。
筛选培养基:含有 smg/Lphosphinothricin(ppt， Duehefa，Netherland)的
309/L蔗糖(北京益利精细化学品有限公司)，7克/L琼脂， pH5.8的MS基本培
养基。
生根培养基:含有 3mg/LpPt29/Lphytagel(Sigma，美国)，60克/L蔗糖(北
京益利精细化学品有限公司)， pH5.8的MS基本培养基。
6 Gus 瞬时表达的检测
将转化后的材料在 28℃光照条件下培养 16h 后，然后继续在 26℃避光培养 48h，按
Jefferson 的方法对 GUS 活性进行组织化学检测。将愈伤组织浸泡于配制好的X一Gluc的溶液中37℃保温过夜，第二天将愈伤组织取出，依次用50%、70%、100%的酒精脱色。最后用灭菌蒸馏水冲洗后观察并照像。
GUS 活性检测液的配制：
100mmol/L 磷酸氢钠缓冲液 pH7.0，
500μmol/L K3Fe(CK)6，
500μmol/L K4Fe(CK)6，
0.5mg/mL X-G1uc，
1.0mmol/L EDTA