篇一:《微生物群落》
生态环境 2005, 14(1): 127-133 Ecology and Environment E-mail: editor@jeesci.com
微生物群落结构和多样性解析技术研究进展
车玉伶1，王 慧1，胡洪营1，梁 威2，郭玉凤1
1. 清华大学环境科学与工程系，北京 100084；2. 中国科学院水生物所，湖北 武汉 430072
摘要：微生物群落结构和多样性是微生物生态学和环境科学研究的热点内容，对于开发微生物资源，阐明微生物群落与其生境的关系，揭示群落结构与功能的联系，从而指导微生物群落功能的定向调控具有重要意义。基本按照年代顺序概述了常用的微生物群落结构及多样性解析技术，同时也体现了解析技术由片面向全面、由低分辨水平向高分辨水平的发展过程。20世纪70年代以前，对环境微生物群落结构及多样性的认识依赖传统的培养分离方法，方法的分辨水平低，认识是不全面的和有选择性的；20世纪70年代和80年代，在微生物化学成分分析的基础上建立了生物标记物方法（醌指纹法、磷脂脂肪酸法等），对微生物群落结构和多样性的认识进入到较客观的层次上；在80和90年代，以DNA为目标物的现代分子生物学技术（rRNA基因测序技术、基因指纹图谱等）比较精确地揭示了微生物种类和遗传的多样性，并给出了关于群落结构的直观信息。指出了每种解析技术的功能特点和局限性，并展望了解析技术的发展趋势是原位、快速、灵敏、高通量和准确定量。 关键词：微生物群落结构；微生物多样性；解析技术；研究进展
中图分类号：Q938.1 文献标识码：A 文章编号：1672-2175（2005）01-0127-07
微生物群落的种群多样性一直是微生物生态学和环境学科研究的重点。近几年来，微生物群落结构成为研究的热点。首先，群落结构决定了生态功能的特性和强弱。其次，群落结构的高稳定性是实现生态功能的重要因素。再次，群落结构变化是标记环境变化的重要方面。因此，通过对目标环境微生物群落的种群结构和多样性进行解析并研究其动态变化，可以为优化群落结构、调节群落功能和发现新的重要微生物功能类群提供可靠的依据。
从年代上来看，微生物群落结构和多样性解析技术的发展可以分为三个阶段。20世纪70年代以前主要依赖传统的培养分离方法，依靠形态学、培养特征、生理生化特性的比较进行分类鉴定和计数，对环境微生物群落结构及多样性的认识是不全面和有选择性的，方法的分辨水平低。在70和80年代，研究人员通过对微生物化学成分的分析总结出了一些规律性的结论，从而建立了一些微生物分类和定量的方法即生物标记物方法，对环境微生物群落结构及多样性的认识进入到较客观的层次上。在80和90年代，现代分子生物学技术以DNA为目标物，通过rRNA基因测序技术和基因指纹图谱等方法，比较精确地揭示了微生物种类和遗传的多样性，并给出了关于群落结构的直观信息。
现在仍被广泛使用。传统培养分离方法是将定量样品接种于培养基中，在一定的温度下培养一定的时间，然后对生长的菌落计数和计算含量，并通过在显微镜下观察其形态构造，结合培养分离过程生理生化特性的观察鉴定种属分类特性。培养分离方法采用配比简单的营养基质和固定的培养温度，还忽略了气候变化和生物相互作用的影响，这种人工环境与原生境的偏差使得可培养的种类大大减少(仅占环境微生物总数的0.1%～10%[1])。而且，此方法繁琐耗时，不能用于监测种群结构的动态变化。
2 群落水平生理学指纹方法(CLPP)
通常认为微生物所含的酶与其丰度或活性是密切相关的。酶分子对于所催化的生化反应特异性很高，不同的酶参与不同的生化反应。如果某一微生物群落中含有特定的酶可催化利用某特定的基质，则这种酶-底物可作为此群落的生物标记分子之一，标记了某种群的存在。由Garlan和Mills[2]于1991年提出的群落水平生理学指纹方法(CLPP)是通过检测微生物样品对底物利用模式来反映种群组成的酶活性分析方法。具体而言，CLPP分析方法就是通过检测微生物样品对多种不同的单一碳源基质的利用能力，来确定那些基质可以作为能源，从而产生对基质利用的生理代谢指纹。由BIOLOG公司开发的BIOLOG氧化还原技术，使得CLPP方法快速方便。商业供应的BIOLOG微平板分两种：GN和MT，二者都含有96个微井，每一
1 传统培养分离方法
传统培养分离方法是最早的认识微生物群落结构和多样性的方法，自1880年发明以来一直到
基金项目：国家863高技术研究发展专项资助项目（2002AA601150）
作者简介：车玉伶（1972－），女，工程师，硕士研究生，主要研究方向为微生物种群结构解析与功能调控。E-mail: cheyl02@mails.tsinghua.edu.cn 收稿日期：2004-09-20
微井平板的干膜上都含有培养基和氧化还原染料四唑[3]。其中，BIOLOG的GN微平板含有95种不同碳源和一个无碳源的对照井，而MT微平板只含有培养基和氧化还原染料，允许自由地检测不同的碳源基质[3]。检测的方法是：将处理的微生物样品加入每一个微井中，在一定的温度下温育一定的时间(一般为12 h)，在温育过程中，氧化还原染料被呼吸路径产生的NADH还原，颜色变化的速率取决于呼吸速率，最终检测一定波长下的吸光率进行能源碳的利用种类及其利用程度的分析[4]。
BIOLOG方法能够有效地评价土壤和其它环境区系的微生物群落结构[3~6]。其优点是操作相对简单快速，而且少数碳源即能区别碳素利用模式的差别[5]。然而，BIOLOG体系仅能鉴定快速生长的微生物，而且，测试盘内近中性的缓冲体系、高浓度的碳源及有生物毒性的指示剂红四氮唑(TTC)使得测试结果的误差进一步增大。姚槐应[5]的研究表明，应根据测试对象的特点（例如pH，碳源利用类型及利用能力）改进BIOLOG体系，并且，有必要研究更好的指示剂来取代TTC。
3 生物标记物方法
生物标记物(Biomakers)通常是微生物细胞的生化组成成分，其总量通常与相应生物量呈正相关。由于特定结构的标记物标志着特定类型的微生物，因此一些生物标记物的组成模式(种类、数量和相对比例)可作为指纹估价微生物群落结构。由于分类的依据是从混合微生物群落中提取的生化组成成分，潜在地包括所有的物种，因而具有一定的客观性。并且分析简便快速，适于定性甚至半定量地检测微生物体系的动态变化。20世纪80年代以来常用于研究微生物群落结构的生物标记物方法包括：醌指纹法(Quinones Profiling)、脂肪酸谱图法(PLFAs和WCFA-FAMEs)。测定时，首先使用合适的提取剂提取环境微生物样品中的这些化合物并加以纯化，然后用合适的溶剂制成合适的样品用GC或LC检测，最后用统计方法对得到的生物标记物谱图进行定性定量分析。
3.1 醌指纹法(Quinones Profiling)
呼吸醌广泛存在于微生物的细胞膜中，是细胞膜的组成成分，在电子传递链中起重要作用[7]。醌的含量与土壤和活性污泥的生物量呈良好的线性关系的研究表明，醌含量可用作微生物量的标记[8]。有两类主要的呼吸醌：泛醌(ubiquinone, UQ)即辅酶Q和甲基萘醌(menaquinone,MK)即维生素K[9]。醌可以按分子结构在类(UQ和MK)的基础上依据侧链含异戊二烯单元的数目和侧链上使双键饱和的
氢原子数进一步区分。研究表明，每一种微生物都含有一种占优势的醌[7]，而且，不同的微生物含有不同种类和分子结构的醌[9]。因此，醌的多样性可定量表征微生物的多样性，醌谱图（即醌指纹）的变化可表征群落结构的变化。
用醌指纹法描述微生物群落的参数[7]有：(1)醌的类型和不同类型的醌的数目；(2)占优势的醌及其摩尔分数含量；(3)总的泛醌和总的甲基萘醌的摩尔分数之比；(4)醌的多样性和均匀性；(5)醌的总量等。对两个不同的群落，由上述分析所得数据可以计算出另一个参数____非相似性指数(D)，用于定量比较两个群落结构的差异。
醌指纹法具有简单快速的特点，近几年来广泛用于各种环境微生物样品(如土壤，活性污泥和其它
水生环境群落)的分析。胡洪营[7]
考察了醌指纹法分析活性污泥群落的分析精度，证明此方法是一种可靠的分析方法。然而，醌指纹法也存在一定的局限性，它不能反映具体哪个属或哪个种的变化。 3.2 脂肪酸谱图法(PLFAs、WCFA-FAMEs和其它方法)
从微生物细胞提取的脂肪类生化组分是重要的生物量标记物，例如，极脂(磷脂)、中性脂类(甘油二酯)可分别作为活性和非活性生物量的标记物[10]。更重要的是，提取脂类的分解产物____具有不同分子结构的混合的长链脂肪酸，隐含了微生物的类型信息，其组成模式可作为种群组成的标记。多种脂肪酸谱图法广泛用于土壤、堆肥和水环境微生物群落结构的分型和动态监测[11~13]。
常用的脂肪酸谱图法可分为两种：磷脂脂肪酸(PLFAs)谱图法和全细胞脂肪酸甲酯(WCFA-FAMEs)谱图法[14]。二者分析的对象实质上都是脂肪酸甲酯，不同之处在于提取脂肪酸的来源不同。磷脂脂肪酸(PLFAs)谱图法提取的脂肪酸主要来源于微生物细胞膜磷脂即来源于活细胞，全细胞脂肪酸甲酯(WCFA-FAMEs)谱图法提取的脂肪酸来源于环境微生物样品中的所有可甲基化的脂类即来源于所有的细胞（包括活细胞和死细胞）。因此，磷脂脂肪酸(PLFAs)谱图法的优点在于准确，可靠；全细胞脂肪酸甲酯(WCFA-FAMEs)谱图法的优点在于提取简捷，所需样品量少。对多个环境微生物样品分析而言，先用WCFA-FAMEs谱图法预先筛选再用PLFAs法进行分析是提高效率的较佳选择。
脂肪酸谱图分析包括两种形式：一种是脂肪酸，采用GC分析仪达到分离不同结构的分子的目的；另一种是脂肪酸甲基化产物____脂肪酸甲酯，采用GC-MS分析仪进行不同分子的分离和鉴定。
相比较而言，后者的仪器要求较高，但增加了分类鉴定的功能。脂肪酸谱图方法在微生物的分类鉴定上不够精确，只能粗略分为几个大的类群(细菌，真菌，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌等)[2]。美国商品化的MIDI系统(Microbial Identification System)[10]拥有许多常见微生物的特征PLFAs谱图，增强了磷脂脂肪酸谱图法的定性能力，而且应用此系统只需GC分析即可描述种群结构并对某些特征菌属进行识别鉴定。
脂肪酸异丙酯(FAPEs)谱图法是最近发展的一种脂肪酸谱图法。脂肪酸异丙酯(FAPEs)谱图法采用强度更低的试剂(酸性异丙醇)和更简便的处理方法，将提取脂肪酸异丙基化，分析的对象是脂肪酸异丙酯。Alan G. Werker[14]等同时采用MIDI-FAME法和脂肪酸异丙酯(FAPEs)谱图法分析了大型生化废水处理厂活性污泥中的种群结构，结果发现二者相似但存在着差别，可期待用校正因子的方法来比较二者的差别。Alan G. Werker等研究还发现脂肪酸异丙酯(FAPEs)谱图法具有简便、灵敏、可重复的特点，可以认为脂肪酸异丙酯(FAPEs)谱图法有潜在应用于分析微生物种群结构的价值。
脂肪酸谱图法对微生物的分类水平较低，不能鉴定到种。另外，复杂的环境微生物样品中不同微生物种属之间脂肪酸组成的重叠和外来生物污染也限制了脂肪酸谱图法对种群结构解析的可靠性。
4 现代分子生物学方法
现代分子生物学方法以微生物基因组DNA的标记序列为分类依据，通过分析不同DNA分子的种类及其数量来反映微生物的种群结构。可以用于微生物群落结构分析的基因组DNA的序列信息包括：核糖体操纵子基因序列(rRNA)、已知功能基因的序列、重复序列和随机基因组序列等。最常用的标记序列是核糖体操纵子基因(rRNA)。rRNA(rDNA)在细胞中相对稳定，同时含有保守序列及高可变序列，是微生物系统分类的一个重要指标。其中，16s rRNA分子大小适中(约1.5 kb)，既能体现不同菌属之间的差异，又宜于利用测序技术而得到有关系统发育关系的充足信息，故被广泛采用。
相对于宏观生物而言，不同微生物的差异在形态上并不明显，而突出表现在基因水平上。这正是现代分子生物学的优势所在，在物种的鉴定上，它有着精细的分辨能力(可达菌株)。另外，与生物标记物一样，DNA(RNA)是微生物都含有的生化组成成分，能够比较客观地反映微生物群落的组成情况。现代分子生物学方法包括群落水平总DNA分析方法，核酸杂交技术，克隆文库方法和基因指纹
技术。
4.1 群落水平总DNA分析方法
群落水平总DNA分析方法是把由环境微生物样品提取的混合总DNA视为一个整体，在整体水平上衡量群落结构和多样性的情况。群落水平总DNA分析方法可分为三种。____(1)两个群落的总DNA杂交技术以其中一个样品的混合总DNA为模板，将另一样品的混合总DNA作探针，使二者杂交，杂交的程度反映了群落结构相似的程度。Griffiths等[15]用此技术比较不同土壤的基因相似性。此技术不适合检测DNA序列相似性较高的群落之间的差别。(2)提取总DNA的热变性和复性动力学技术____DNA热变性后同源单链发生重组行为，复性DNA的比例通常可以表达为核苷酸浓度(C0)和反应时间(t)的积函数(C0t)，在特定的条件下，半数DNA发生复性时的C0t1/2值与总DNA的复杂度呈正比[2]。C0t1/2被用作评价土壤菌群的基因多样性指数[16]，也被用于评价外来化合物对土壤菌群的影响[17]。(3)密度梯度法____测定群落总DNA的碱基组成百分数方法，此方法使用插入剂二苯并咪唑与A+T碱基对结合，可放大因不同的G＋C含量而引起的DNA分子质量的差别。将提取的群落总DNA在二苯并咪唑存在的条件下进行CsCl密度梯度离心，产生了群落总DNA的(G＋C)％分布的指纹图，表征种群结构情况。原核生物DNA的(G＋C)％在24%~76％范围内[18]，而且，染色体的(G＋C)％通常表征细菌的系统发育组在属的水平上的分类，因此，对应于某一(G＋C)％值的DNA的相对含量就代表了某个菌属在菌群中的相对含量。有研究者用此方法监测了土壤菌群因碳素影响而发生的变化[18]。
群落水平总DNA分析方法需要大量的完整的DNA，是一种比较粗糙的分析方法。 4.2 核酸杂交技术
核酸分子杂交技术是20世纪70年代发展起来的一种分子生物学技术，基于碱基互补配对的原理，用特异性的DNA探针(用放射性元素或荧光染料标记)与待测样品的DNA(RNA)杂交形成杂合分子，杂交后的信号由仪器检测并定量。近年来，由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的高度灵敏性，使得核酸分子杂交技术广泛应用于微生物多样性的研究中，定性定量分析它们的存在、分布和丰度。
对于环境微生物样品解析而言，最有意义的核酸杂交技术是“原位”杂交技术(in situ hybridiza-tion)。原位杂交分为三个层次。第一，对环境样品
直接原位杂交。可获得自然环境下微生物多样性的大量信息，如微生物的种类、形态特征和丰度以及在样品上的空间分布和动态[19]。第二，对培养菌落做原位杂交。可进行微生物的鉴定和计数。第三，对提取的DNA或PCR扩增的rDNA产物做原位杂交，即电泳凝胶平板的原位。可得到微生物的种类鉴定及丰度等信息。
在原位杂交技术中，应用最广泛的是荧光原位杂交技术(FISH)。FISH技术安全、简便、灵敏、快速，可同时检测几种微生物。高灵敏度检测仪器的使用也增加了FISH的分析能力，例如电荷耦合相机(CCD)和相应的图像分析软件使得图像数字化，方便用于微生物的计数[19]；共焦激光扫描显微镜(CLSM)能除去焦外荧光，使得图像强度高，适用于
较浓稠或有较高背景值的样品(如活性污泥)[20]
；流式细胞计(FCM)可以对混合的微生物种群进行单细胞分类和计数，分析自动化，适用于对水生微生物群落的组成和动态进行快速和频繁的监测[21]。{微生物群落}.
原位PCR技术和DNA微阵技术的引入增强了核酸杂交技术解析微生物群落结构和多样性的能力。原位PCR技术在细胞内进行PCR使目的片段扩增，然后用FISH法检测靶序列或者在PCR时掺入标记的引物而直接检测[22]，此法检测的灵敏度高，可检测出基因组中单拷贝的基因，已用于海水、河水和生物膜的微生物群落研究[23,24]。DNA微阵技术含多种不同DNA探针，有揭示群落总体多样性的潜力，可测定结构和多样性已知的群落的变化，更因其高度并行性、微型性、自动化和快速检测的特点，显示出广阔的应用前景。
总之，核酸杂交技术适于鉴定和定量环境微生物群落中特定分类单位(域、属、种、亚种)的微生物，也可监测特定种群或种类的变化，但不适于描述群落结构和总体多样性，因为实际中使用的探针种类或引物的套数是有限的。 4.3 克隆文库分析法
克隆文库分析法是将PCR扩增的环境微生物样品总DNA的rRNA片断(或其它标记基因)克隆进合适的载体，构建克隆文库以分离不同的序列，然后对分离的序列采用测序技术或PCR/RFLP进行定性分析。对于测得的序列，可以通过与GeneBank数据库中已有数据的对比鉴定其分类地位，许多序列可以鉴定到种的水平。通过分析rRNA片断的类型和出现频率，可以得到微生物群落结构和多样性的信息[25]。
克隆文库分析法是广泛使用的一种方法[26]。但是，只有在分析的克隆数目足够多的情况下，才可
以比较完整地认识种群组成的情况。而且，PCR和克隆策略引入的误差会对克隆出的rDNA序列及其鉴定产生重要影响。因此，种群多样性从总体上讲并不真实。另外，克隆文库分析法成本高，工作量大，分析时间长，不适合对微生物群落结构变化进行动态跟踪研究。
4.4 基因指纹图谱方法
基因指纹图谱是用PCR扩增环境微生物样品总DNA的标记序列，然后用合适的电泳技术将其分离而成的具有特定条带特征的图谱。基因指纹模式的不同就反映种群结构的不同。按分离依据不同，基因指纹图谱可分为DNA长度多态性分析图谱和变性梯度凝胶电泳图谱。 4.4.1 DNA长度多态性分析图谱
DNA长度多态性分析的依据是生物的DNA片段的长度多态性，最初用于快速检定特定种群及进行菌株鉴定[27]，后来用于研究微生物群落结构和多样性。常用的DNA长度多态性技术有RFLP(ARDRA,T-RFLP)、RAPD和ERIC-PCR。
(1)RFLP(ARDRA,T-RFLP)指纹图谱。RFLP(限制性片段长度多态性)法采用限制性内切酶识别双链DNA分子中特异的短列，在特定的位点将DNA切开，来自不同个体基因组的含同源序列的酶切片段具有不同的长度。通过常规的电泳分离，不同长度的片段停留在不同的位置，即形成了限制性片段长度多态性指纹图谱[27]。ARDRA(扩增rDNA限制性分析)和T-RFLP(末端RFLP)都是由RFLP发展而来的方法。ARDRA的扩增对象为rDNA[28]。T-RFLP法在PCR扩增进程中使用荧光标记的引物，因而PCR产物被末端标记。
RFLP(ARDRA,T-RFLP)方法通常选择rRNA (rDNA)的基因作为扩增对象，广泛用于研究土壤、水体和海洋沉积物等区系微生物群落的结构和多样性[25,28]。RFLP(ARDRA,T-RFLP)方法要求已知微生物特定分类水平的DNA序列文库，以便设计和合成特异的引物，限制性酶的选择是其关键之处[2]。RFLP和ARDRA图谱的复杂度高，而T-RFLP方法只检测末端限制片段，得到的谱图简单一些。
(2)RAPD技术和ERIC-PCR指纹图谱。RAPD(随机扩增多态性DNA)方法利用随意设计的短的非特异引物(通常10bp)在不严格的PCR条件下(低退火温度)对基因组DNA随机扩增，其扩增产物电泳而产生了长度多态性指纹图谱[29]。RAPD方法克服了RFLP方法的局限性，不需了解DNA序列，而且对少量完整性较差的DNA，也能得到分辨率较好的指纹图谱。姚健等用RAPD方法分析了农用化学品污
染对土壤微生物群落DNA序列多样性的影响，得出群落DNA序列多样性指数、丰富度和均匀度，并比较不同群落基因相似程度[30]。在DNA长度多态性技术中，使用最多的就是RAPD技术。
ERIC-PCR方法实际上是一种长引物RAPD技术。1991年hulton等人[31]首次在肠道细菌基因组中发现了ERIC(Enterbacterial Repetitive Intergenic Consensus)序列，随后ERIC-PCR技术被广泛用于细菌分类和菌种鉴定上。1997年Gillings和Holley[32]采用ERIC-PCR技术从没有典型ERIC重复序列的真菌、植物等物种的基因组DNA中扩增出稳定的多态性丰富的图谱，进一步证实ERIC-PCR技术是针对重复序列的PCR分型技术，实际上是一种长引物RAPD技术。1999年以后ERIC-PCR指纹图谱技术被成功用于分析人或动物的肠道菌群、活性污泥、土壤等多种微生物群落结构的分析[33~35]。长引物RAPD技术与普通RAPD技术不同之处有两个：一是引物为一对，且长度通常大于16碱基；二是退火温度高于52℃，而普通RAPD通常低于40 ℃。与普通RAPD技术相比，ERIC-PCR方法具有谱图稳定、重复性高、对序列差异敏感性强和多态性丰富等特点。
DNA长度多态性分析能够监测微生物群落结构的动态变化或者比较两个环境微生物样品种群结构的差异。它的局限性在于：(a)不能提供关于种群组成的信息；(b)重现性差；(c)由于长度相同的DNA片断其序列可能不一样，可能会高估样品间的相似性。
4.4.2 变性梯度凝胶电泳(DGGE/TGGE)图谱
变性梯度凝胶电泳(DGGE/TGGE)依据双链DNA片断熔解行为的不同，用于分离PCR产物中长度相同但序列不同的DNA标记片断(rRNA或rDNA)[36]。变性梯度凝胶电泳的基本原理是：在由DNA变性剂或温度形成的线性梯度的聚丙烯酰胺凝胶中，发生了部分熔解的双链DNA分子的电泳速率下降，不同序列的分子将在胶的不同位置停止迁移[20]。从理论上讲，DGGE/TGGE指纹图上的一个条带就代表一个微生物类群(分类水平可达种)。因而，指纹图谱直观反映了微生物群落的结构和多样性，还方便判断出优势菌或功能菌。回收某一条带的DNA片断，经PCR再扩增后测定其序列，通过与基因序列数据库中的已知序列比较，可以确定其种系发育位置。经过序列检定的基因序列，还可设计成探针，以荧光原位杂交技术监测微生物群落中特定类型的微生物的变化。
DGGE/TGGE最初用于检测人类基因组的突
变，自被Muyer(1993)引入环境微生物学领域以来，现已广泛用于分析微生物的区系结构组成及动态变化[37,38,39]。此方法的局限性在于扩增序列的长度不能过大，因为超过500bp以上就不能在高效地分离。这就限制了对rrs基因区域的选择，限制了鉴定基因的准确度。另外，已有研究表明，不同序列的片断可能迁移到同一位置。所以，依据条带数得到的谱图的分辨结果不足以精确地揭示微生物群落的结构和多样性。
基因指纹